Глава 6 Регуляция клеточного деления Циклины и циклин-зависимые киназы — стр.17

Глава 6 Регуляция клеточного деления Циклины и циклин-зависимые киназы - стр.17

Сохрани ссылку в одной из сетей:

Глава 6. Регуляция клеточного деления.

Циклины и циклин-зависимые киназы

Основное свойство высших эукариот — определенное время жизни организма. Это

свойство поддерживается в индивидуальных соматических клетках, чей рост, деление и

гибель точно регулируемый процесс. Сбой регуляции приводит к неконтролируемому

клеточному росту — раку.

Одним из ключевых событий в жизни соматической клетки является ее деление на две

дочерних — митоз. Период между двумя делениями называется интерфазой. Интерфаза и митоз

представляют собой хорошо организованную последовательность событий, известную как

клеточный цикл. Разграничением между клеточными циклами являются стадии митоза. Важным

свойством клеточного цикла является его сложная регуляция.

6.1. Периоды клеточного цикла

Клеточный цикл разделяется на четыре периода:

* G1 фаза (от «gap 1», то есть интервал 1) — период высокой метаболической

активности и роста клетки между митозом и репликацией ДНК.

* S фаза (от «synthesis») — период синтеза (репликации ДНК). Количество ядерной

ДНК увеличивается в два раза от 2n до 4n.

* G2 фаза («gap 2») — период подготовки к митозу. Продолжается клеточный рост и

синтез необходимых белков

* M фаза (от «mitosis») — деление клетки на две дочерние с уменьшением в них

количества ДНК от 4n до 2n. Митоз — сложный процесс, в ходе которого происходит

конденсация хроматина с образованием узнаваемых хромосом, перемещение

центриолей в противоположные части клетки, реорганизация и реконструкция

микротрубочек в веретено деления, разрыв ядерной оболочки, вызванный

деполимеризацией поддерживающих ее структуру белков — ламинов (профаза),

прикрепления микротрубочек к кинетохорам хромосом(прометафаза), выстраивание

хромосом по клеточному экватору (метафаза), расхождение сестринских хроматид к

противоположным полюсам клетки(анафаза), реорганизация ядерных оболочек и

непосредственное деление цитоплазмы (телофаза) и клетки (цитокинез).

Типичные быстро делящиеся клетки человека (клетки костного мозга, слизистой

оболочки кишечника, волосяных фолликул и др.) проходят клеточный цикл за 24 часа.

Быстро делятся клетки эмбриона — сразу после оплодотворения яйцеклетки. Они проходят

клеточный цикл за 30 мин, однако при этом не происходит клеточный рост, то есть зигота

делится на большое количество маленьких клеток. Некоторые клетки взрослого организма

либо прекращают делиться вообще (например, нервные клетки), либо делятся случайно, для

замены погибших или поврежденных в результате ранения клеток при получении сигнала

извне (например, фибробласты кожи). Такие клетки вышли из фазы G1 в фазу покоя G0,

оставаясь при этом метаболически активными. Клеточный цикл других клеток может

остановиться и в G2 фазе. В диплоидном мире эти клетки в дальнейшем обычно остаются

тетраплоидными, как это бывает, например, на некоторых стадиях эмбриогенеза насекомых.

В гаплоидном мире остановка клеточного цикла в G2 фазе происходит всегда, так как это

позволяет предохранять ДНК от повреждений из-за наличия в клетке двух ее копий, вместо

одной копии в G1 фазе.

6.2. Понятие ограничительной и сверочных точек

Способность клетки надолго задерживаться в G0 фазе свидетельствует о наличии

регуляторного механизма, который принимает решение о выходе из клеточного цикла или его

продолжении. Точка клеточного цикла, в которой принимается соответствующее решение,

получила название ограничительной точки (restriction point) у высших эукариот и СТАРТ

(START) у почкующихся дрожжей S.cerevisiae. Пройдя эту точку клеточного цикла клетка

необратимо выходит из G1 фазы и проходит все остальные его фазы вплоть до следующей

точки, где принимается новое решение. У дрожжей переход через СТАРТ регулируется

размером клетки и наличием во внешней среде питательных веществ. Переход через

ограничительную точку высших эукариот в основном зависит от наличия во внешней среде

факторов роста. Так, например, выход фибробластов кожи из фазы покоя и запуск их

клеточного цикла осуществляется под действием тромбоцитарного фактора роста (PDGF),

который появляется во внешней среде при свертывании крови в зоне ранения.

По мере прогрессии клеточного цикла должны существовать механизмы проверки

правильности выполнения его событий. Такая проверка осуществляется в нескольких точках

клеточного цикла получивших название сверочных точек (checkpoint). Эти точки

расположены в концах G1, G2 и М фаз. В первой точке осуществляется проверка наличия

повреждений ДНК, во второй наряду с повреждениями ДНК проверяется завершенность

репликации, в третьей проверяется правильность расхождения хромосом в митозе. Если

обнаруживается какое-либо из вышеперечисленных нарушений, то происходит остановка

клеточного цикла, что дает время для их исправления. Если исправление оказывается

невозможным, то происходит запуск механизма апоптоза — программируемой клеточной смерти.

6. 3. История изучения клеточного цикла

Картина регуляции клеточного цикла стала проявляться лишь последнее десятилетие в

результате сотрудничества исследователей ооцитов амфибий и генетиков дрожжей.

Эксперименты, проведенные в начале 1970-х показали, что яйца взрослых лягушек Xenopus

laevis производят фактор, который будучи введенным в незрелые ооциты, находящиеся в G2

фазе, запускает в них мейоз, таким образом, готовя их для оплодотворения. Обычно,

это «взросление» вызывает прогестерон. Фактору, который достоверно не был

прогестероном, дали имя maturation-promoting factor или MPF. Так называемый «анализ

лягушачьих ооцитов» позволил проверить многие клеточные экстракты на наличие MPF. Успех

анализа зависел от появления в течение взросления белого пятна, которое появляется,

потому что митотическое веретено перемещается из центра клетки на новую позицию, на

которой обычно находятся пигменты. Экстракты из многих клеток от дрожжей до человека

имели MPF активность, но она проявлялась не на всех стадиях клеточного цикла. Экстракты

из клеток в G1 и S фазе не содержали MPF. Однако когда клетка приближалась к митозу,

активность появлялась, а после деления резко исчезала.

Вторым направлением исследований была генетика дрожжей с различными мутациями,

изменяющими нормальное течение клеточного цикла. Делящиеся дрожжи S.pombe оказались

удобным объектом исследования. Было выделено множество мутантных штаммов с нарушенным

клеточным циклом. Одна из мутаций, сdc2 (сell division cycle), была обнаружена в начале

1980-х Paul Nurse. Продукт гена cdc2 играет важную роль в работе молекулярного

аппарата клеточного цикла. Теперь известно, что это протеин киназа с молекулярным

весом 34000д. Очень близкая к ней протеинкиназа, являющаяся продуктом гена CDC28, с

аналогичной функцией была обнаружена Lee Hartwell у почкующихся дрожжей S. cerevisiae.

Эти киназы обозначаются вместе как р34. В дальнейшем они и их гомологи,

выделенные из других организмов были названы Cdk (Cyclin dependent

kinase), то есть циклин-зависимыми киназами.

В 1983 году Tim Hunt изучал контроль белкового синтеза в яйцах морского ежа и

обнаружил, что через 10 минут после оплодотворения появился новый белок. Белок

появлялся и исчезал с каждым клеточным делением, из-за чего его назвали циклином.

Выделение и очищение MPF было очень долгим процессом. В 1988 году было обнаружено,

что MPF состоит из двух белков с молекулярными массами 34000 и 45000д. Анализ первого

белка антителами к р34 дрожжей показали, что это одинаковые белки. Дальнейшая работа

показала, что второй компонент MPF — циклин.

В 2001 году Paul Nurse, Tim Hunt и Lee Hartwell за свои революционные

исследования регуляции клеточного цикла получили Нобелевскую премию по физиологии и

медицине.

6. 4. Циклин-зависимые киназы и циклины

Циклин зависимые киназы (Cdk) — это клеточные машины, которые запускают события

клеточного цикла и являются своеобразными часами этих событий. Кроме того, они

выполняют функцию информационных процессоров, которые интегрируют внеклеточные и

внутриклеточные сигналы для тонкой координации событий клеточного цикла. Изучение Cdk

необходимо для понимания фундаментальных механизмов контроля клеточного цикла.

Каталитическая активность Cdk обеспечивается высокоспецифичными сайтами

связывания, что позволяет двум субстратам правильно расположиться относительно друг

друга и произвести перенос фосфата АТФ на кислород ОН группы белка-субстрата. Типичная

каталитическая субъединица чуть больше, чем минимальный протеинкиназный домен. Члены

семейства Cdk состоят из примерно 300 остатков аминокислот. Из них 35-65% идентичны

прототипу cdc2/cdc28.

Каталитические субъединицы Cdk не действуют в одиночку. Их способность включать

события клеточного цикла полностью зависит от взаимодействия с циклиновыми

субъединицами. Отсюда и происходит название cyclin dependent kinase. Хотя связывание с

циклином и является определяющим, существуют дополнительные регуляторные субъединицы и

протеин киназы, которые модулируют активность CDK, распознавание субстрата и

субклеточную локализацию. Cdk определяются как белковые киназные каталитические

субъединицы. Продукт cdc2 гена, р34, считается прототипом циклин-киназной единицы и

служит эталоном для сравнения других циклин-киназ.

В регуляции клеточного цикла дрожжей участвует всего одна циклин зависимая киназа —

р34. В разные периоды клеточного цикла она активируется присоединением

соответствующего циклина и фосфорилирует специфические для этого периода субстраты

(рис. 32). Видно, что периоды активностей Cdk перекрываются.

У позвоночных открыто более десяти белков подобных cdc2/cdc28. Большинство Cdk

являются некритическими регуляторами клеточного цикла. Лишь Cdk1 и Cdk2, структурные

гомологи cdc2/cdc28, выполняют в нем главную роль. В настоящее время известно восемь

циклинов, обозначаемых латинскими буквами от А до Н. Все циклины имеют общую

последовательность длиной 100-150 аминокислотных остатков, называемую циклиновым

боксом, которая необходима для связывания с CDK. На основании анализа кристаллической

структуры циклин А1 состоит из двух компактных центральных доменов, каждый из которых

представлен пятью спиралями, и двух дополнительных спиралей у С- и N-конца.

Рис. 32. Движение по клеточному циклу определяется последовательной активацией

различных комплексов циклин-CdK. Большинство из них — мишени активирующего действия

онкогенов или ингибирующего действия опухолевых супрессоров.

Эти данные позволяют предположить, что пятиспиральный домен является ядром всех

циклинов. Циклин подобные домены имеют некоторые pRb белки (р35) и фактор транскрипции

6.5. Регуляция активности Cdk

Известно по крайней мере четыре механизма регуляции активности Cdk:

1. Первичный механизм активации — связывание с субъединицей циклина.

2. Полная активация Сdk путем фосфорилирования с помощью циклин активирующей киназы

CAK (cyclin activating kinase)

3. Ингибирование активной Cdk путем связывания с регуляторной субъединицей CKI

(cyclin kinase inhibitor).

4. Ингибирование Cdk фосфорилированием ингибирующего сайта.

Рассмотрим эти механизмы.

1.Связывание с циклином. По определению, активация Cdk требует его связывания с

циклином. На рис. 33 представлен такой комплекс. Ясно, что все Cdk не связывают все

циклины, так как в их взаимодействии есть значительная специфичность. Биохимические

свойства Cdk-циклин взаимодействия варьируют в различных комплексах. Некоторые

комплексы, как например циклин В — Cdk1, циклин А — Cdk2 и циклин Е — Cdk2,

взаимодействуют с высокой активностью в отсутствии каких-либо дополнительных

компонентов или модификаторов. Другие, например циклин А — Cdk2 и циклин Н — Cdk7, не

взаимодействуют до тех пор, пока субъединица Cdk не будет фосфорилирована по

треониновому остатку. В необычных случаях требуется третья субъединица — Mat1.

Рис. 33. Структура Cdk2-циклин А1-АТФ комплекса человека. Cdk2 расположена слева.

Циклин А — справа. Т-петля обозначена черной стрелкой. Связывание Cdk2 и циклина А

включает взаимодействие между спиралью PSTAIRE Cdk-2 и спиралями 3 и 5 циклина А, а

также между спиралью N циклина А и С-терминальной областью Cdk2. Связывание циклина

вызывает значительные конформационные изменения в Cdk2. Спираль 1.12 Т-петли

расположена в ?-цепи, позволяя спирали PSTAIRE двигаться вовнутрь, чтобы корректировать

расположение участка цепей, участвующих в ориентировке фосфата АТФ. Т-петля является

уплощенной относительно ее позиции в мономере.

2.Активирующее фосфорилирование Cdk. Связывание циклина А с Cdk2 увеличивает

киназную активность последней на несколько порядков. Это объясняется конформационными

измененими Cdk. В основном изменения касаются Т-петли Cdk. В несвязанном состоянии Т-

петля закрывает сайт связывания с белком-субстратом, что препятствует его

взаимодействию с АТФ. Кроме того, небольшая спираль на конце петли (Helix L12) вызывает

конформационные изменения АТФ-связывающего сайта, что не позволяет фосфату

ориентироваться правильно относительно белка субстрата (Рис. 33). Образование циклин-

киназного комплекса происходит благодаря взаимодействию спирали PSTAIRE киназы со

спиралями 3 и 5 циклина, а также С-концевой доли киназы и спирали N циклина. При этом

спираль L12 распрямляется и превращается в бета-складку, что позволяет спирали PSTAIRE

переместиться ближе к АТФ связывающему центру. Перемещение спирали PSTAIRE исправляет

конформацию АТФ — связывающего сайта, делая его активным, так как теперь фосфат

ориентирован правильно. Кроме того, Т-петля выравнивается, становясь плоской, и сайт

связывания с белком-субстратом становится доступным.

Дополнительное фосфорилирование треонина-161 Т-петли CAK (cyclin activating

kinase) приводит к дополнительной активации Cdk2 в 80-300 раз. Механизм этой активации

следующий: фосфат треонина-161 встроен в катионный карман под Т-петлей и действует как

центральный узел для сети водородных связей, стабилизирующих взаимодействие Cdk2 и

циклина А. При этом Т-петля выравнивается в одной плоскости еще сильнее и приближается

к циклину, что приводит к конформационным изменениям формы связывающего белок центра.

Других конформационных изменений не происходит. Следовательно, фосфорилирование Cdk

необходимо лишь для улучшения связывания с белковым субстратом.

К CAK (cyclin activating kinase) высших эукариот относится тримерный комплекс

Cdk7-циклин Н-Mat1. Он способен связываться с TFIIH — фактором репарации, а также

фактором транскрипции, участвующим в работе РНК полимеразы II. Активность Cdk7 не

является регулятором клеточного цикла у позвоночных.

3 Ингибиторы Cdk. Существует два основных семейства CKI (cyclin kinase

inhibitor) белков, осуществляющих ингибирование Cdk. Представители первого семейства

Cip/Kip (CDK inhibitory protein) — р21, р27 и р57, ингибируют Cdk2 и Cdk4/6 циклиновые

комплексы, осуществляя G1 и G1/S контроль. Представители второго семейства INK4

(inhipitor of kinase 4) — р15, р16, р18 и р19, узкоспецифичны для CDK4/6-цD комплексов

и осуществляют аналогичные функции.

Лучше всего изучена структура молекул семейства Cip/Kip. Эти белки содержат два

мотива: короткий мотив на N-конце для связывания с циклином и более сложный сегмент у С-

конца для связывания с CDK. Получена кристаллическая структура комплекса Cdk2-циклин А-

р27. Структура р27, связанного с комплексом Cdk2-цА, представлена на рис. 34. Малая

спираль на С-конце р27 помещается в центр связывания АТФ, чем и объясняется его

ингибирующая активность.

Рис. 34. Структура связи комплекса cdk2-циклин А1 с усеченным пептидом р27. Циклин А1

и cdk2 расположены как на рис. 33. Пептид р27 (затемнен) протянут через вершину

комплекса, причем N-конец связан с циклином А1, а С-концевая область на некотором

протяжении взаимодействует с субъединицей Сdk2, разрывая ?-складку малой доли и внедряя

малую спираль в АТФ-связывающий сайт. Сdk2 в этом комплексе фосфорилирована киназой

CAK по Thr160 Т-петли. Представленная структура иллюстрирует эффект фосфорилирования,

что приводит к дальнейшему сплющиванию Т-петли относительно ее позиции в

нефосфорилированном комплексе.

Последовательности, близкие к циклин связывающим мотивам для р21 и р27, были

найдены в факторе транскрипции E2F и pRb, которые взаимодействуют с циклином А. Таким

образом, Cip/Kip, по-видимлму, ингибируют фосфорилирование этих субстратов, конкурируя

с ними за связывание с циклином.

Как следует из функциональных особенностей CKI, их активация происходит, когда

дальнейшее продолжение клеточного цикла нежелательно. Так, например, лишение клеток

питательных веществ приводит к увеличению уровня р27, а внеклеточный ингибитор роста

TGF- вызывает увеличение уровня р15. Повреждения ДНК активирует транскрипцию р21 под

действием белка р53. Белок p21 способен ингибировать белок PCNA, принимающий участие в

репликации ДНК. Таким образом, осуществляется остановка клетки в сверочной точке G1

фазы, что позволяет клетке репарировать повреждения ДНК.

6.6. Ингибирующее фосфорилирование.

Cdk могут также ингибироваться фосфорилированием. Ингибиторное фосфорилирование

вносит вклад в отсчет времени митоза. До митоза комплекс циклин В-cdc2 (Cdk1)

инактивирован фосфорилированием по треонину-14 и тирозину-15. Фосфорилирование остатков

у позвоночных осуществляется Myt1 и Wee1 соответственно. К концу G2 резкое

дефосфорилирование этих двух остатков активирует cdc2 и запускает митоз.

Дефосфорилирование осуществляется фосфатазами семейства CDC25. Во время митоза Myt1,

Wee1 и CDC25 фосфорилированы. Это уменьшает активность Myt1, тогда как активность CDC25

увеличивается, что способствует активации cdc2. Интересно, что циклин В-cdc2 может

непосредственно активировать CDC25. Такая прямая обратная связь и обеспечивает резкое

дефосфорилирование. Кроме циклин В-cdc2 в фосфорилировании CDC25 принимают участие

представители семейства Polo киназ (Polo like kinase 1 — Plk1 у млекопитающих).

6.7. Регуляция циклинов

Регуляция циклинов осуществляется на двух уровнях: транскрипции генов и деградации

белка. Регуляция транскрипции генов циклинов у высших эукариот изучена на примере

перехода ограничительной точки клеточного цикла. Центральную роль в этом переходе

играет E2F, фактор транскрипции некоторых генов, необходимых для синтеза ДНК в S фазе.

Он стимулирует также транскрипцию генов циклина А, циклина Е и своего собственного

гена. Белок pRb ингибирует E2F, связываясь с последним в G1 фазе.

Факторы роста стимулируют транскрипцию циклина D через Ras-Raf-MAP сигнальный

каскад или под действием цАМФ. Происходит накопление комплексов циклин D-Cdk4, которые

начинают фосфорилировать Rb, что приводит к его диссоциации от E2F. Освободившийся E2F

стимулирует транскрипцию своего гена и гена циклина Е. Образующийся вследствие этого

комплекс CDK2-цЕ, еще активнее фосфорилирует pRb. Таким образом, сеть эффектов через

петлю положительной обратной связи приводит к быстрому возрастанию E2F зависимой

транскрипции и переходу клетки в начало S фазы. Вскоре после этого в клетке появляются

комплексы Cdk2-цА, которые фосфорилируют E2F, уменьшая его способность связываться с

Другим способом регуляции циклинов является их разрушение протеолизом. Таким

образом контролируется, например, выход из митоза. Деструкция митотических циклинов

необходима для начала телофазы и подготовки к следующему циклу. Возле N-конца

митотические циклины А и В несут небольшую последовательность, называемую боксом

деструкции. Эта последовательность необходима для конъюгации циклина с убиквитином,

который является маркером для узнавания циклина протеазой. Большая часть цитозольного

протеолиза осуществляется протеосомами. Протеосомы — это нелизосомальные

мультикаталитические протеиназы, обнаруженные у эукариот, широко распространенные в

цитоплазме. Они обладают 20S каталитическим ядром (М = 700 кд) которое осуществляет АТФ-

зависимую деградацию убиквитинированных белков. 20S протеосома состоит из 14

субъединиц, представляющих собой различные протеазы. Они образуют бочкообразную

структуру с активными центрами внутри. Большие протеазные комплексы, по крайней мере,

из десяти различных полипептидов образуют дно и крышку такой бочки. Из роль, видимо,

заключается в транспорте убиквитинированных белков в центр бочки.

Ключевым регуляторным компонентом в деструкции митотических циклинов является

мультисубъединичный комплекс APC (anaphase promoting complex) или циклосома. Этот

комплекс осуществляет присоединение убиквитина к циклинам и другим субстратам. Комплекс

имеет различную субстратную специфичность в переходе метафаза-анафаза и выходе из

митоза, так как связан в эти периоды с двумя различными регуляторными белками — Сdc20 и

Hct1 соответственно. Одним из субстратов ACP-Сdc20 является комплекс белков секурина и

сепарина, который удерживает вместе сестринские хроматиды хромосомы. APC-Сdc20

способствует разрушению секурина, под действием освободившегося сепарина сестринские

хроматиды расходятся, то есть осуществляется переход в анафазу. Комплекс APC-Hct1

осуществляет убиквитинирование циклина В. АСР активируется после длительного лаг-

периода посредством циклин А-Cdk2 и инактивируется под действием G1 циклинов.

Таким образом, молекулярные механизмы, которые запускают все события клеточного

цикла, должны работать по принципу «все или ничего», действуя необратимо и постоянно.

Клеточный цикл можно рассматривать как продукт программы резкого возрастания и падения

активности Cdk. Активация одного циклин-киназного комплекса должна быть не только

триггером событий клеточного цикла, но и должна инициировать активацию следующего

циклин-киназного комплекса. Таким образом, запрограммированная последовательность

передачи сигнала от одного комплекса к другому представляет собой часы клеточного цикла.

Классическим примером автономного колебания активности Cdk является колебание

активности комплекса циклин В-cdc2 (MPF) в раннем эмбрионе лягушки Xenopus. После

деструкции комплекса циклин А-cdc2 и выхода из S фазы постоянный синтез циклина В

приводит к его накоплению и, следовательно, образованию комплексов циклин В-cdc2.

Первоначально эти комплексы неактивны, так как они ингибированы фосфорилированием по

треонину-14 и тирозину-15 киназой Wee1. Однако по мере их накопления достигается порог

концентрации, при котором они могут фосфорилировать CDC25 и Wee1, вызывая

соответственно их активацию и ингибирование. Фосфорилированная CDC25 дефосфорилирует и

активирует циклин-киназный комплекс. Положительная обратная связь этих двух процессов

вызывает резкое возрастание киназной активности циклин В-cdc2. Повышенная киназная

активность вызывает переход клетки к митотическому статусу через фосфорилирование

различных клеточных субстратов. После слабо изученной лаг-фазы активированный циклин-

киназный комплекс инициирует деградацию циклина под действием убиквитин-зависимого

протеолиза. Разрушение циклина вызывает потерю киназной активности и выход из митоза.



Сохрани статью себе в соцсеть!




Комментарии ( 0 )
    Оставить комментарий

    Ваш электронный адрес не будет опубликован. Обязательные поля помечены *