Принцип метода проточной цитометрии в клинической лабораторной диагностике

Количественная цитометрия – относительно новая методика микробиологического исследования дисперсионных сред, проводимая с помощью специального оборудования. Цитометрия бывает статической и проточной.

Статическая цитометрия проводится с использованием конфокальных микроскопов; при их отсутствии в ход идут слегка модифицированные люминесцентные микроскопы, оснащенные простыми и дешевыми системами анализа изображений.

Проточная цитометрия осуществляется на специальных аппаратах – сортерах и проточных цитрометрах.

Оба варианта количественной цитометрии имеют широчайшие возможности применения в практике медицинских и биологических исследований. Несмотря на разность используемого клинического материала и экспериментальных моделей решаемые ими задачи подчиняются общим принципам исследования.

Что такое проточная цитометрия?

Проточной цитометрией называют методику исследования дисперсионных субстанций в режиме поштучного анализа частиц, входящих в состав дисперсной фазы по сигналам, получаемым в ходе флуоресценции и рассеивания света.

Название методики точно отражает сущность обозначаемого процесса, состоящего в исследовании потока одиноких биологических частиц.

Методика проточной цитометрии была создана на базе специальных экспериментов по определению размера исследуемых частиц и подсчету их количества.

Первый клеточный сортер был создан в 1965 году, а с начала следующего десятилетия был налажен выпуск приборов, предназначенных для измерения интенсивности флуоресценции при нескольких длинах волн с целью определения сразу нескольких параметров изучаемых клеток.

Современные исследователи для осуществления проточной цитометрии используют приборы двух типов:

Устройство современных проточных цитометров настолько сложно и разнообразно, что с трудом поддается какому-либо обобщению и систематизации, однако несколько общих моментов, характерных для всех приборов, все же существует:

В ходе медицинских и биологических исследований изучаются образцы, приготовленные из клеток:

Принцип метода проточной цитометрии

Принципы, заложенные в основу процедуры цитометрии, чрезвычайно просты.

Суспензия, приготовленная из клеток, предварительно помеченных флуоресцирующими моноклональными антителами или флуорохромами, помещается в поток дисперсионной среды, пропускаемый через проточную ячейку.

Гидродинамическое фокусирование струи клеточной суспензии в струе дисперсионной среды приводит к тому, что исследуемые клетки или их ядра выстраиваются поодиночке и в таком порядке пересекают пучок сфокусированных световых (обычно лазерных) лучей.

Под воздействием определенных световых волн происходит одновременное возбуждение молекул разных флуоресцирующих красителей, что делает возможным анализ сразу нескольких параметров клеточных структур.

Свет, исходящий от флуорохромов, фокусируют при помощи оптической системы, состоящей из нескольких зеркал и линз, а затем раскладывают на определенные компоненты.

Полученные световые сигналы подвергают анализу и преобразованию в электрические импульсы, а затем – в определенные формы, приемлемые для компьютерной обработки и хранения полученной информации.

Флуорохромы

Для того чтобы облегчить процесс определения клеточных структур в ходе процедуры проточной цитометрии, используемую дисперсионную среду подкрашивают специальными флуоресцирующими красителями – флуорохромами.

После такой обработки исследуемые клетки приобретают способность флуоресцировать (светиться) под воздействием пучка световых лучей.

При выборе того или иного красителя пользуются целым рядом критериев:

Одним из самых востребованных флуорохромов является йодистый пропидий: его спектральные характеристики идеально подходят для выполнения проточной цитометрии.

Чтобы активизировать флуоресценцию, используя йодистый пропидий, исследователи прибегают к помощи обычного аргонового лазера (рабочая длина его волны составляет 480 нм). Площадь флуоресцирующего участка такова, что позволяет использовать вышеозначенный флуорохром для выполнения многопараметрических измерений.

Для проведения проточной цитометрии также используют:

В качестве флуорохромов могут использоваться также флуоресцирующие моноклональные антитела.

Вне зависимости от того, какой именно краситель принимает участие в процедуре, его количество должно быть прямо пропорционально содержанию ДНК в структуре клетки.

Чтобы добиться качественного прокрашивания всех клеточных структур, количество применяемого флуорохрома должно быть избыточным.

Большинство флуорохромов, вступающих в контакт с ДНК, не способно пройти сквозь мембраны неповрежденных (интактных) клеток. Для повышения проницаемости клеточных мембран исследуемые клетки обрабатывают поверхностно-активными веществами (детергентами) или спиртом.

Преимущества

Несомненными преимуществами проточной цитометрии можно считать:

Где применяется?

Спектр применения проточной цитометрии необыкновенно широк. Она применяется даже в индустрии, для контроля производственного процесса. Продемонстрируем это, для наглядности представив информацию в виде списков.

В онкологии

В этом разделе медицины проточную цитометрию применяют с целью:

Видео о методе проточной цитометрии в диагностике острых лейкозов:

Иммунологии

Метод проточной цитометрии позволяет:

Цитологии

Проточная цитометрия дает исчерпывающие данные, позволяющие:

Гематологии

С помощью проточной цитометрии гематологи могут:

Фармакологии

Проточная цитометрия помогает фармакологам:

Сельском хозяйстве

Метод проточной цитометрии активно используется учеными, специализирующимися на селекции новых видов растений и выведении пород домашнего скота, поскольку она позволяет:

• Астрономы впервые увидели, как «кипит» красный гигант
• О мире вокруг нас: почему Луна видна днем?
• Загрязнение воздуха ТЭЦ. Экология ТЭЦ
• Атмосферное давление: нормальное, пониженное и повышенное
• Строение клетки человека. Определения. Основа основ
• Простейший преобразователь гравитационной энергии в механическую
• Управление судном на мелководье и в узкости
• 8. Юбки полусолнце, три четверти солнца и солнце - Юбки - Раскрой и шитье женской одежды - Всё о шитье
• Физики из России и Португалии создали уникальный микроскоп, способный изучать структуру и свойства нанотрубок
• Ученые создали сенсор из графена, позволяющий определять тяжелые металлы